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    疫苗

    安安物联开发了多种HLA人源化模型，，，，并建立了先进的体内外研究平台。。这些模型使小鼠的抗原提呈细胞（APCs）能够呈递和识别与人类相同或相似的肽表位，，，从而加速肿瘤疫苗的研发进程。。。。

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    • 介绍
    • 肿瘤疫苗的临床前评估能力
    • 肿瘤疫苗评估的案例研究
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      介绍

      肿瘤疫苗指的是将肿瘤抗原以多种形式，，如患者来源的肿瘤细胞、、肿瘤相关蛋白或多肽、、表达肿瘤抗原的基因等，，，通过人工合成的方式将这些抗原辅以佐剂或通过树突状细胞等作为递送载体，，，制备成疫苗制剂导入患者体内。。。疫苗进入体内后，，肿瘤抗原被DC细胞吞噬，，，，继而被加工呈递给T细胞，，，，激活抗原特异性细胞毒性T细胞，，，，从而杀伤肿瘤。。最理想的肿瘤特异性抗原是由肿瘤细胞基因突变产生，，，在正常组织中不表达的新生抗原（neoantigen），，，，它可以被递呈到细胞表面和MHC分子结合后，，，，被T细胞识别。。。

      疫苗已从单纯的预防手段发展为兼具治疗功能的应用，，其类型涵盖传统的蛋白疫苗、、、、肽疫苗，，以及先进的mRNA疫苗等。。安安物联基于HLA人源化小鼠和HLA人源化肿瘤细胞株，，，构建了多种免疫原性评估模型和肿瘤治疗效果模型。。这些模型使小鼠的抗原提呈细胞（APCs）能够呈递和识别与人类相同或相似的肽表位，，从而加速肿瘤疫苗的开发。。同时，，，，我们还建立了先进的体内与体外研究平台，，能够全面评估疫苗的免疫原性、、、有效性、、作用机制及安全性。。。。

      肿瘤疫苗的临床前评估能力
      Immunogenicity validation Efficacy validation MOA exploration
      • Ex Vitro:
        • Antigen-specific ELISpot analysis
        • Antigen-specific T cells detection
        • Titration of neutralizing antibodies
        • ADCC assay
      • In Vivo:
        • Wild type C57BL/6 mice
        • HLA humanized mice
        • Immune reconstitution models
      • Ex/In Vitro:
        • Antigen-specific ELISpot analysis
        • Antigen-specific T cells detection
        • Antigen-specific CTL analysis
        • Titration of neutralizing antibodies
        • ADCC assay
      • In Vivo:
        • Syngeneic tumor models
        • Xenograft models (PDX models, CDX models)
      • In Vitro:
        • Antigen transduction and expression
        • DC/immune cell activation
      • Ex Vitro:
        • TILs analysis (FACS, pathology)
        • Cytokine release (ELISA, MSD)
      • In Vivo:
        • Biodistribution
      肿瘤疫苗评估的案例研究

      疫苗评估的动物模型：

      同种移植模型：

      • C57BL/6 + TAA人源化细胞系
      • HLA人源化小鼠 + HLA/靶点人源化细胞系
        • B-HLA-A2.1 mice
        • B-hCD3E&HLA-A2.1 mice
        • B-hCD3E&h4-1BB&HLA-A2.1 mice
        • B-HLA-A24.2 mice
        • B-HLA-A11.1 mic

      异种移植模型：

      • HLA人源化B-NDG小鼠 + 人源细胞系
      • HLA人源化B-NDG小鼠 + CD34+ HSC/PBMC免疫重建 + 人源细胞系
        • B-NDG HLA-A2.1
        • B-NDG hB2M&HLA-A2.1 mice plus
        • B-NDG hB2M&HLA-A11.1 mice
      案例研究1：基于HLA人源化小鼠的mRNA疫苗免疫原性检测及体内药效评估
      mRNA疫苗（NY-ESO-1）的免疫原性检测
      Immunogenicity testing of mRNA vaccines (NY-ESO-1)

      图1. 在B-HLA-A2.1小鼠中检测mRNA疫苗诱导的免疫反应。。。6-8周龄的雌性B-HLA-A2.1小鼠分为PBS组和mRNA疫苗组（n = 6），，，分别在双腿内侧肌肉注射PBS或疫苗。。。最后一次免疫后1周处死小鼠，，，，提取脾细胞，，，，用特异性肽段或与靶标无关的多肽作为阴性对照（NC）进行刺激，，，然后检测IFN-γ分泌和抗原特异性T细胞。。（A）实验方案。。（B）各组间体重无显著差异。。数据以均值±SEM表示。。

      Figure 2. Detection of mRNA vaccine-induced immune responses in B-HLA-A2.1 mice by IFN-γ ELISpot assay.

      图2. 使用IFN-γ ELISpot测定法检测B-HLA-A2.1小鼠中mRNA疫苗诱导的免疫反应。。。。（A）疫苗接种和检测方案。。9-10周龄的雄性B-HLA-A2.1小鼠分为PBS组、、LNP组和LNP-mRNA组（n = 3），，，，分别在双腿内侧肌肉注射PBS、、、LNP或LNP-mRNA，，，，每组仅免疫一次。。。。免疫后1周处死小鼠，，，，提取脾细胞，，用特异性肽、、、、无肽（阴性对照）或PMA/Ionomycin（阳性对照）刺激后检测IFN-γ分泌。。（B）免疫小鼠脾细胞分别用阴性对照肽、、疫苗肽和阳性对照刺激后的代表性检测结果（重复两次）。。（C）检测结果汇总，，，数据以均值±SEM表示。。。NC：阴性对照。。。PC：阳性对照。。。

      Figure 3. Detection of mRNA vaccine-induced immune responses in B-HLA-A2.1 mice by IFN-γ ELISpot assay.

      图3. 使用IFN-γ ELISpot测定法检测B-HLA-A2.1小鼠中mRNA疫苗诱导的免疫反应。。。（A）疫苗接种和检测方案。。。。9-10周龄的雄性B-HLA-A2.1小鼠分为PBS组、、、LNP组和LNP-mRNA组（n = 3），，，在双腿内侧肌肉分别注射PBS、、、LNP或LNP-mRNA。。。。。。小鼠共免疫3次，，间隔1周。。。。最后一次免疫后1周处死小鼠，，，分离脾细胞，，，用特异性肽段、、无肽（阴性对照）或PMA/Ionomycin（阳性对照）刺激后检测IFN-γ分泌。。。。（B）免疫小鼠脾细胞分别用阴性对照肽、、、、疫苗肽和阳性对照刺激后的代表性检测结果（重复两次）。。。。（C）结果总结。。。。数据以均值±SEM表示。。。。NC：阴性对照。。。。PC：阳性对照。。

      B-HLA-A2.1小鼠 + B-HLA-A2.1/NY-ESO-1 MC38模型用于mRNA疫苗评估
      Figure 1. Antitumor activity of LNP-mRNA against syngeneic tumors.

      图1. LNP-mRNA对同种异体肿瘤的抗肿瘤活性。。。。（A）实验方案。。。。（B）LNP或LNP-mRNA治疗的抗肿瘤活性。。B-HLA-A2.1小鼠（n = 6 /组）分别接种PBS、、、、LNP或LNP-mRNA（10 μg/只）。。。将B-HLA-A2.1/hNY-ESO-1 MC38细胞接种到小鼠右侧腹部。。。（C）治疗过程中的体重变化。。如图B所示，，，，LNP-mRNA在B-HLA-A2.1小鼠中有效控制肿瘤生长。。。。（D）mRNA对同种异体肿瘤的抗肿瘤活性。。。B-HLA-A2.1/hNY-ESO-1 MC38肿瘤细胞在各小鼠中的生长。。数据以均值±SEM表示。。

      Figure 2. (A and B) Detection of vaccine-induced immune responses in B-HLA-A2.1 mice by IFN-γ ELISpot assay.

      图2.（A和B）使用IFN-γ ELISpot测定法检测B-HLA-A2.1小鼠中疫苗诱导的免疫反应。。。。NC：阴性对照。。。。PC：阳性对照。。。。（C和D）LDH释放实验检测来自B-HLA-A2.1小鼠的CTLs对B-HLA-A2.1/hNY-ESO-1 MC38细胞系的细胞毒性。。通过LDH释放实验检测从免疫小鼠的脾细胞分离出的CTLs对NY-ESO-1肽脉冲的B-HLA-A2.1/hNY-ESO-1 MC38细胞系的细胞杀伤活性，，，效应细胞与靶细胞比率为50:1或100:1，，，，使用两种不同的肽浓度，，10μg或50μg。。。数据以均值±SEM表示。。。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的多重比较测试，，，，对每个治疗组与PBS组进行比较 **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。。。。

      Figure 3. Vaccination mRNA vaccine generates specific effector CD8+ T cells in spleens.

      图3. mRNA疫苗接种在脾脏中生成特异性效应CD8+ T细胞。。。从接种PBS、、、LNP、、、LNP-mRNA疫苗的B-HLA-A2.1/hNY-ESO-1 MC38肿瘤小鼠脾脏中提取的脾细胞。。。（A）采用流式细胞术检测脾脏中CD8+ T细胞、、、CD4+ T细胞和Tregs的比例。。。结果显示，，，在CD45+细胞中，，，T细胞和CD8+ T细胞的比例显著升高。。mRNA疫苗诱导的四聚体阳性CD8+ T细胞占总CD8+ T细胞的比例约为50%。。这些CD8+ T细胞在初始型和中心记忆型中的比例较低，，，，主要分布于效应记忆型群体中。。（B）从免疫小鼠分离的脾细胞经NY-ESO-1肽刺激后进行胞内细胞因子染色分析。。。。IFN-γ主要由CD8+ T细胞分泌，，而不是CD4+ T细胞。。数据以均值±SEM表示。。。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的多重比较测试，，对每个治疗组与G1组进行比较。。。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。。。

      Figure 4. LNP-mRNA enhances beneficial repertoire of anti-tumor T cells.

      图4. LNP-mRNA增强抗肿瘤T细胞的有益库。。来自接种PBS、、、空LNP或LNP-mRNA的B-HLA-A2.1/hNY-ESO-1 MC38肿瘤小鼠的肿瘤。。。（A）采用流式细胞术检测肿瘤浸润的CD8+ T细胞、、、、CD4+ T细胞和调节性T细胞（Tregs）。。。结果显示，，，，肿瘤浸润的T细胞和CD8+ T细胞在CD45+细胞中的比例显著增加，，，，而LNP-mRNA组的Tregs比例显著下降。。。。肿瘤内CD8+ T细胞中，，，初始型细胞频率明显降低，，效应记忆型CD8+ T细胞显著增加。。。（B）从免疫小鼠肿瘤组织中分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）经NY-ESO-1肽刺激后进行胞内细胞因子染色分析。。CD8+和CD4+ T细胞均能产生IFN-γ。。。。数据以均值±SEM表示。。。。统计分析使用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的多重比较测试，，，对每个治疗组与G1组进行比较。。。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001。。

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